Jason Bourne se cache et participe à des combats à mains nues, illégaux, pour assurer sa survie. De son côté, Nicky Parsons collabore avec le hacker et lanceur d'alerte Christian Dassault. À Reykjavik, en Islande, elle s'introduit dans les serveurs de la CIA et copie des fichiers sur les opérations noires de l'agence. Elle trouve également des documents sur le recrutement de Jason Bourne dans l'opération Treadstone et l'implication de Richard Webb, le père de Bourne. Son intrusion a cependant été détectée et des agents de la CIA implantent un logiciel espion dans une mémoire de masse qu'elle emporte. Ignorant la présence du logiciel, elle se rend en Grèce pour montrer à Bourne ses recherches, suivie à distance par Heather Lee, chef de la division sur le cyber-espionnage, qui rapporte ses allées et venues à Robert Dewey, directeur de la CIA.
En Grèce, Parsons et Bourne se rencontrent sur la place Syntagma, qui est le théâtre d'une violente manifestation surveillée par des policiers anti-émeute. Ils échappent à l'équipe envoyée pour les éliminer, mais Parsons est tuée par l'Atout (seul nom qui lui est donné pendant le film), un ancien tueur de la CIA sous les ordres de Dewey. Avant de mourir sous le coup d'une seconde balle, elle donne la clé d'une consigne où se trouvent les documents volés à la CIA. Résolu de trouver des réponses sur son passé, Bourne se rend à Berlin pour voir Dassault. Après que Dassault soit parvenu à déchiffrer les documents, Bourne découvre que son père, Richard Webb, a travaillé pour le compte de l'agence et est à l'origine de l'opération Treadstone. Entretemps, le logiciel espion informe Heather Lee de l'endroit où se trouve Bourne et Dewey dépêche une équipe pour le supprimer. Quelques instants plus tard, Lee détruit à distance les documents, puis informe Bourne qu'une équipe est en route, croyant que Bourne veut travailler à nouveau pour l'agence.
En se basant sur quelques indices, Bourne se rend à Londres pour retrouver Malcolm Smith, un ancien agent de surveillance ayant agi pour l'opération Treadstone. Lee défend son projet de « récupérer » Bourne auprès d'Edwin Russell, le directeur du renseignement national et supérieur de Dewey ; Russell acquiesce et Lee prend ses dispositions pour rencontrer Bourne. Dewey semble se plier à cette décision, mais ordonne en secret à l'Atout d'abattre l'équipe de Lee puis Bourne, parce qu'il ne partage pas les opinions de Lee. Se sachant sous surveillance, Bourne échappe à l'équipe de Lee et à l'Atout suffisamment longtemps pour confronter Smith. Ce dernier admet que Richard Webb a créé l'opération Treadstone mais s'est opposé au recrutement de Jason. Il affirme que Dewey a ordonné la mort de Richard, meurtre accompli par l'Atout, mais maquillé comme une attaque terroriste pour persuader Jason de joindre les rangs de la CIA. L'Atout tue Smith et blesse Jason, qui parvient à s'enfuir. Il prend contact avec Lee, qui lui déclare ne pas approuver les méthodes de Dewey ; elle lui donne rendez-vous à un congrès technologique à Las Vegas aux États-Unis.
Dewey se rend aussi au même congrès, pour participer à un débat sur le droit à la vie privée avec Aaron Kalloor, PDG de Deep Dream, société qui exploite un réseau social consulté par plus d'un milliard de personnes. Kalloor se présente comme le champion de la protection de la vie privée, mais tait sa collaboration secrète avec la CIA qui ambitionne d'utiliser le réseau de Deep Dream comme outil de surveillance de masse en temps réel, pour redonner vigueur aux opérations Treadstone, Blackbriar, Outcome et LARX. Soupçonnant que Kalloor refusera de poursuivre sa collaboration avec la CIA, Dewey ordonne à l'Atout d'abattre Kallor et Lee, cette dernière par manque de loyauté aveugle. Au congrès, Bourne contrecarre in extremis les meurtres, puis confronte Dewey dans sa suite. Le directeur de la CIA fait appel au sens du devoir et au patriotisme de Bourne dans le but de le retenir auprès de lui, sachant que des agents de la CIA se rapprochent, dont son bras droit Jeffers. Bourne tue ce dernier, puis Lee tue Dewey avant qu'il ne tire sur Bourne. Pour protéger Lee, il prend la responsabilité de la mort de Dewey. En quittant l'hôtel, il aperçoit l'Atout qui s'enfuit. Au terme d'une poursuite automobile dans Las Vegas et d'un corps à corps intense, Bourne tue l'Atout.
Quelque temps plus tard, Lee rencontre Edwin Russell et affirme pouvoir être ses oreilles et ses yeux dans l'agence. Elle a toujours le projet de ramener Bourne dans le giron de la CIA, mais accepte qu'il soit tué s'il ne veut pas revenir. Quelques minutes plus tard, Lee rejoint Bourne, promettant de changer la CIA pour le mieux. Bourne demande du temps pour réfléchir à sa proposition, mais en lui laissant dans sa voiture un enregistrement de sa conversation avec Russell, il montre qu'il n'a pas confiance en elle, puis il s'enfuit à nouveau.
En 2012, le duo d'agents « Men in Black » J et K fonctionne toujours après 15 ans d'association, mais J s'interroge de plus en plus sur les causes du caractère renfermé de son partenaire. L'agent O, qui a pris la succession de Z à la tête de l'agence, connait les raisons mais les garde pour elle. Sur la Lune, un extraterrestre boglodite très dangereux, Boris l'Animal, s'évade et retourne sur Terre avec un objectif : tuer K, l'agent qui l'a capturé en 1969 et lui a détruit le bras gauche. L'agent K assiste au retour de son vieil ennemi sur Terre, qui le défie et part en lui disant : « Tu es déjà mort, mais tu ne le sais pas encore ». L'agent K avoue plus tard à J que ne pas avoir tué Boris fut sa plus grande erreur, sans donner plus d'explications. J cherche donc de son côté des informations dans les archives de l'agence « Men in Black » mais certaines lui sont interdites d'accès. Dans la nuit qui suit, K disparait et seul J semble se souvenir de lui : pour le reste de l'agence, K est mort sur le terrain à Cap Canaveral le 16 juillet 1969. Mais O comprend par le comportement de J que Boris a remonté le temps et tué K dans le passé, changeant le continuum espace-temps. La mort de K en 1969 a permis une brèche dans le système de sécurité de la Terre et les boglodites se préparent à une invasion. J décide donc de remonter le temps à son tour, partant pour le 15 juillet 1969 afin de retrouver K avant le Boris du présent. Il utilise pour cela un dispositif créé par un compagnon de cellule de Boris, fonctionnant sur la vitesse accumulée, et doit donc sauter du sommet du Chrysler Building ; le fils du compagnon lui explique avant de partir que si J est le seul à se souvenir de K, c'est parce qu'il a vécu les événements qui ont changé l'histoire.
Arrivé en 1969, J part pour Coney Island, où Boris est censé avoir commis son premier meurtre. Là, Boris lui échappe et J est arrêté par K, alors âgé de 29 ans, qui l'emmène aux quartiers du MiB. J y rencontre une version plus jeune de l'agent O, le chef X, mais refuse de donner des informations jusqu'à ce que K le menace par un neuralyseur géant. J admet donc venir du futur pour empêcher une invasion extraterrestre et arrêter Boris ; K décide de le croire et suit les maigres indices dont J se souvient pour suivre Boris, ce qui les mènent dans un bowling puis dans la Fabrique, le repaire d'Andy Warhol, en réalité un repaire extraterrestre surveillé par l'agent W (Warhol lui-même). Ils y rencontrent aussi Griffin, un extraterrestre Arcadien capable de voir l'ensemble des futurs alternatifs. Celui-ci parvient ainsi à fuir avant que Boris ne vienne pour le tuer. J et K le retrouvent au Shea Stadium, où Griffin leur montre grâce à ses capacités la victoire du championnat de ligue nationale de baseball des Mets de New York avant de confier à K le bouclier Arcnet, un système de défense pour la Terre que K doit placer au sommet de la fusée Apollo 11 afin de le déployer. Peu après, Boris réapparait et tente d'enlever Griffin, mais les deux agents le sauvent.
Arrivés à Cap Canaveral, les deux agents et Griffin sont arrêtés avant d'approcher le site de la fusée par la police militaire. Le Colonel est sur le point de les mettre en détention quand Griffin lui montre le futur et ce que J et K vont accomplir ; le Colonel les accompagne alors vers la fusée. Dans la colonne de lancement, J et K font face aux deux versions de Boris (celle de 1969 et celle de 2012). J utilise le voyage temporel pour prendre l'avantage sur son adversaire, le Boris du futur, et le pousser du sommet de la rampe. K parvient de son côté à détruire le bras gauche du Boris de son époque avant de déposer l'Arcnet sur la fusée, permettant son déploiement. Le décollage de la fusée entraine la mort du Boris de 2012, brûlé par le feu des réacteurs.
Peu après, J part rejoindre K et le Colonel. Il voit K proposer au militaire de rejoindre le MiB, mais le Colonel est tué par le Boris de 1969, juste avant que K ne tue Boris sans hésitation. Derrière, J voit un garçon sortir d'un véhicule et demander à voir son père ; J se reconnait dans l'enfant et comprend que le Colonel était son père. J voit ensuite K parler à l'enfant avant de le neuralyser et lui dire que son père est parti mais qu'il doit se souvenir de lui comme d'un héros.
J retourne ensuite dans le présent et rejoint son partenaire âgé. Il lui fait comprendre qu'il connait maintenant l'histoire, et en échange, K lui avoue que ce fut un honneur de l'avoir rencontré ce jour-là, et partent. Griffin, assis quelques sièges plus loin, apprécie d'avoir assisté à cette scène avant de voir que K n'a pas laissé de pourboire ; dans cette version, un astéroïde doit s'abattre sur Terre dans les minutes qui suivent. Cependant, K revient laisser un billet, et l'astéroïde est finalement détruit par une collision avec satellite artificiel. Griffin avoue son soulagement aux spectateurs, brisant le quatrième mur.
Pendant la Seconde Guerre mondiale, Steve Rogers, frêle et timide, se porte volontaire pour participer à un programme expérimental qui va le transformer en un Super Soldat connu sous le nom de Captain America. Allié à Bucky Barnes et Peggy Carter, il sera confronté à la diabolique organisation HYDRA dirigée par le redoutable Crâne Rouge.
L'agent J, autrefois formé par son mentor l'ex-agent K, continue de réglementer l'activité extraterrestre dans les rues de New York pour la secrète agence MIB, depuis 5 ans. Changeant en permanence de partenaires pour diverses raisons, il se voit confier par Z une nouvelle affaire de meurtre impliquant 2 aliens, pendant laquelle J décide de ne pas respecter le règlement, qui oblige à effacer la mémoire des témoins. Il s'apercevra vite que la Terre est (à nouveau) en danger de mort si la lumière de Zartha n'est pas très vite retrouvée. Malheureusement pour J, la seule personne sachant où se trouve cette lumière n'est autre que K, actuellement en retraite. La mission se révèle d'autant plus difficile car il faut que K retrouve la mémoire avant que la puissante Serleena ne trouve elle aussi l'objet de toutes les convoitises, et ce avant minuit.
À Chicago, à l'occasion du crash d'un avion transportant des prisonniers, l'US Marshal Samuel Gerard est aidé par l'un des détenus, Mark Sheridan, pour sauver quelques rescapés, puis voit ce dernier s'évader. Gerard et son équipe le traquent donc, mais découvrent que ce fugitif a une histoire complexe. De son côté, Sheridan essaie de prouver son innocence en confondant ses adversaires.
Les Men in Black, ou MIB, font partie d'une organisation ultra-secrète créée afin de réguler la présence sur Terre des extraterrestres. Grâce à leur technologie avancée, ils sont virtuellement inexistants, effaçant la mémoire des témoins gênants. L'agent K, après que son partenaire ait décidé de mettre un terme à son activité car il se trouve trop vieux, se cherche un nouveau partenaire, qu'il trouve au sein de la police de New York. Pendant ce temps, une « bestiole » (bug dans la version américaine), sorte de cafard géant, cherche à s'emparer d'une galaxie gardée par le prince arquilien, résidant sur Terre.
Les Men in Black (MIB) font partie d'une organisation ultra-secrète créée afin de réguler la présence sur Terre des extraterrestres. Grâce à leurs technologies avancées, ils sont virtuellement inexistants, effaçant la mémoire des témoins gênants. Ainsi, la population ignore la présence de vie extraterrestre au sein de notre planète. Le qualificatif d'hommes en noir vient des complets noirs et des lunettes sombres que les membres de l'organisation doivent porter en tout temps.
K (Tommy Lee Jones), agent de longue date du MIB, vient de perdre son mentor, qui a pris la décision de se retirer en raison de son âge avancé. Il tente donc de se dénicher une nouvelle recrue. Il finit par la trouver en l'officier du NYPD James Darrell Edwards III (Will Smith), jeune homme extraverti qui est capable de pourchasser un alien à pied, et qui possède par ailleurs une bonne intuition.
C'est ainsi que le jeune James devient l'agent J. Cependant, il est encore loin de se douter des épreuves qui l'attendent : une « bestiole » (bug, dans la version américaine), un extraterrestre très peu pacifique semblable à un cafard géant, cherche à s'emparer d'une galaxie gardée par un prince arquilien... L'agent J apprendra rapidement à quel point il est difficile d'assurer l'avenir de la planète alors que les aliens qu'il recherche prennent les corps humains comme déguisements, et que la population doit demeurer dans l'ignorance totale.
Tout va mal à Gotham City. Double-Face s'est échappé de l'asile d'Arkham et ne pense qu'à une chose : tuer Batman qu'il croit coupable de sa défiguration. Au même moment, Bruce Wayne refuse de financer une expérience proposée par Edward Nygma, qui avait pour but de manipuler les cellules cérébrales. Celui-ci jure de se venger, devient l'Homme-Mystère puis s'allie avec Double-Face en lui proposant un marché.
Trente terroristes, avec à leur tête l'ancien agent de la CIA William « Bill » Strannix, envahissent le cuirassé américain USS Missouri alors que celui-ci fait son dernier voyage de Pearl Harbor vers la Californie où il doit être mis à la retraite. Neutralisant les soldats à bord du navire, les terroristes enferment l'équipage dans la cale avant du bateau, aidés secrètement par le Commandant en second du navire, le commandant Peter Krill. Les terroristes mettent ensuite en place un système pour s’emparer des missiles Tomahawk présents à bord du navire pour les revendre, les chargeant dans un sous-marin auparavant volé à la Corée du Nord.
La CIA ayant déjà tenté d'assassiner Strannix lors d'un évènement se déroulant avant l'histoire du film, lui et ses hommes sont sur leurs gardes et n’hésitent pas à utiliser le système d'armes du navire pour se défendre, abattant un avion à réaction qui était venu enquêter ainsi qu'un hélicoptère de l'équipe d'intervention des Navy SEAL. Ils planifient ensuite de couvrir leur fuite en utilisant quelques uns des missiles du bâtiment pour détruire le système de poursuite-radar de Pearl Harbor.
Mais, parmi l’équipage du Missouri, deux personnes ont réussi à se cacher : l'actrice Jordan Tate, une ancienne playmate (Miss Juillet 1989) engagée pour faire un striptease à bord du navire à l'occasion de la fête d’anniversaire du commandant, et Casey Ryback, le chef cuisinier du Missouri. Ryback est un ancien Navy SEAL rétrogradé pour avoir frappé un supérieur. Il parvient, grâce à ses compétences en armement, tactique, explosifs et en close combat, à se procurer des armes et entreprend de reprendre seul le contrôle du navire. Il élimine un à un les hommes de Strannix, malgré la gêne occasionnée par sa jeune acolyte inexpérimentée.